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                出血性敗血癥診斷技術

                中健網 >> 疾病庫 >> 血液病 >> 敗血癥 2006年08月18日 中健網·血液病 佚名

                  出血敗血癥是黃牛和水牛的一種急性、高度致死性的敗血性疾病。由多殺性巴氏桿菌的某些血清型 ,特別是血清型 6:B (亞洲株 )和 6:E (非洲株 )引起。埃及和蘇丹等幾個國家存在這兩個血清型。出血性敗血癥是一種原發性巴氏桿菌病 ,只能用病原菌的純培養物才能在易感動物復制出這種病。

                  臨床診斷可根據特征的癥狀、眼觀病變、群的歷史、發病和死亡模式。

                  一、病原鑒定 :

                  出血性敗血癥的血病實為病末期。因此 ,從臨死前病畜采取的血液樣品不常含多殺性巴氏桿菌 ,而且也不會在病畜的鼻分泌物中存在。

                  如在病畜死前幾小時內 ,從心臟采取血樣樣品或拭子 ,則最為滿意。如果病畜已死亡較長時間 ,則應取游離組織的長骨 ;如果沒有作死后檢查的設施 ,則可從頸脈采取 (切開或吸取 )血液。放在標準運輸培養基中的血樣應包裝嚴密 ,以防泄露 ,并置冰上后迅速運送。感染動物的血液涂片 ,用革蘭氏或亞甲基蘭染色。該菌為革蘭氏陰性 ,兩極染色的短桿菌。只根據直接顯微鏡檢查 ,尚不能作出確診。

                  適合巴氏桿菌生長的一種培養基 ,是含 5%血液的酪蛋白──蔗糖──酵母瓊酯。它的組成為 :水解酪蛋白 3克 ,蔗糖 3克 ,酵母浸膏 5克 ,氯化鈉 5克 ,無水硫酸氫二鉀 3克 ,加蒸餾水到 1升。將 P H值調為 7. 3- 7. 4后 ,高壓滅菌 15分鐘 ,最后加入無菌瓊脂,使其終末濃度為 1. 5%。待冷卻到 45- 50℃時 ,加 5%犢牛血液 (無多殺性巴氏桿菌抗體 )。

                  血液樣品或用 2- 3毫升無菌正常生理鹽水洗下的拭子物質直接進行培養。如果是長骨樣品 ,則表面先用酒精擦 ,再經火焰滅菌后切開。無菌抽取骨髓樣品 ,作培養。只要材料新鮮 ,無污染或者死后沒有受到其他過分生長的任何巴氏桿菌的侵襲 ,則直接培養通常是滿意的。

                  作生物學檢查時 ,是將少量血液拭子洗滌物或用生理鹽水懸浮的部分骨髓樣品 ,皮下或肌肉內接種 (0. 2毫升 )小鼠 ,鼠通常可抵外來微生物。接種后 ,小鼠一般在 24- 36小時死亡 ,并在鼠的血液涂片中可見到純的多殺牲巴氏桿菌。用鼠的血液培養物一般能獲得純培養。甚至原始樣品來于死亡已久的病畜也如此。細菌可通過形態學與培養特性、生化反應及血清學試驗來鑒別。

                  新鮮分離的多殺性巴氏桿菌在血液瓊脂上于 37℃培養 24小時后 ,能形成光滑的 ,有灰色光澤的 ,半透明的菌落 ,直徑約 1毫米。在瓊脂上 ,菌落較大。陳舊培養物 ,特別是在那些無血培養基上的生長物 ,能形成小的菌落。在麥康凱瓊脂上不生長。革蘭氏染色的血液或組織涂片中 ,出現革蘭氏陽性、短的、卵圓形、兩極著色的球狀菌。有時還有一定程度的多形性 ,特別是陳舊的培養物 ,呈現不同長度桿狀形。用亞甲蘭染色時 ,兩極染色更明顯。

                  出血性敗血癥桿菌能產生氧化酶、過氧化氫酶及吲垛 ,能還原硝酸鹽。不產生硫化氫或尿素酶 ,不能利用檸檬酸鹽或液化明膠。可發酵葡萄糖和蔗糖 ,產酸。大多數菌株也發酵山梨糖醇。有些菌株發酵阿拉伯糖 ,木糖及麥芽糖 ,而對水揚甙及乳糖幾乎不發酵。非出血性敗血癥的多殺性巴氏桿菌血清型的鑒定可用幾種血清學方法進行 ,包括快速玻片凝集試驗 ,作莢膜分型間接血凝試驗。用鹽酸處理的菌體凝集試驗作菌體抗原分型 ,以及瓊脂凝膠擴散試驗。

                  大多數血清學試驗中所用的抗血清是用兔抗參考菌株制備的。將酪蛋白──蔗糖──酵母肉湯的 6- 8小時培養物 ,接種到血液瓊脂培養基上 ,培養過夜 (18- 20小時 )后 ,用含 0. 3%福爾馬林的生理鹽水將生長物洗下。將菌體懸液的濁度調到布朗氏比濁管的第7管。每隔 3- 4天 ,兔靜脈注射一次菌液 ,量分別為 0. 2、 0. 5、 1. 0、 1. 5及2. 0毫升 (最后 )。末次注射后一周 ,取 0. 5毫升相同的活菌懸液 ,給兔皮下或肌肉內接種 , 10天后放血。血清保存于 4℃ ,但少量常用的血清加 1: 10000的硫柳汞后 ,在 4℃保存。

                  1、快速玻片凝集試驗

                  將一個菌落用一滴生理鹽水在玻片上混合 ,加一滴抗血清 ,并慢慢加熱玻片。在 30秒內可出現粗的紫狀凝集。陳舊的培養物則出現細的顆粒狀凝集 ,且時間較長。

                  2、間接血凝試驗 (莢膜定型 )

                  該方法最初用人的“ O”型紅細胞 ,現在常用綿羊紅細胞。抗原制備如下 :將參考菌株6: B或 6: E的 6- 8小時肉湯培養物 ,接種到酪蛋白──蔗糖──酵母血瓊脂板上 , 37℃培養過夜。用含 0. 3%福爾馬林的 3毫升生理鹽水將生長物洗下。然后 ,在 56℃加熱 30分鐘 ,在 4℃以 3000g離心 15分鐘 ,上清液保存在 - 20℃。如果不能冷凍離心 ,則以 1500g離心 30分鐘 ,上清液用作抗原提取物。

                  無菌采集綿羊血液 ,加入抗凝劑 ,以 500g離心 10分鐘。沉淀的紅細胞用無菌生理鹽水洗 3次。抗血清 (3體積 )中加入沉淀的紅細胞 (1體積 ),在 37℃吸收 2小時 ,期間搖動幾次。加提取的抗原 (15體積 )到紅細胞 (1體積 )中 ,在 37℃振蕩致敏 1小時,離心收集致敏的紅細胞。再用無菌生理鹽水洗 3次 ,最后用生理鹽水配成 1%懸液。試驗可在試管或血凝板中進行 ,每次做相同的兩份。第一孔加 8滴生理鹽水 , 2滴滅活的吸附過的抗血清 ,所有其他的每扎加 5滴生理鹽水。血清 1滴稀釋混合后取 5滴加到倒數第二孔 ,最后一孔為無血清對照孔。第一排加同體積 (5滴 )1%的致敏紅細胞懸液 ,第二排加 1%的未致敏紅細胞懸液作為對照。將血凝板搖動后 ,置室溫作用 2小時。紅細胞的粗糙凝集為陽性結果 ;出現小鈕扣紅細胞沉積為陰性反應。

                  3、菌體抗原定型

                  將 6- 8小時的待檢培養物接種到酪蛋白──蔗糖──酵母血瓊脂培養基上 ,培養過夜。每塊板用 2~ 3毫升 0. 3%福爾馬林生理鹽水將生長物洗下混合后 ,在 4℃以 3000g離心 15分鐘或以 1200- 1500g在室溫離心 30- 45分鐘 ,沉積的細菌用 25毫升鹽酸生理鹽水重懸到布朗氏比濁管第 6管的濁度 ,再培養過夜。懸液再離心 ,上清液棄去,沉淀的細菌分別用 P H為 5. 0、 6. 0及 7. 0的磷酸緩沖鹽水連續洗滌。

                  最后 ,用 P H 7. 0的磷酸緩沖鹽水將沉淀的菌體懸浮到相當于布朗氏比濁管第 6管的濁度。如果懸液發生自凝 ,則棄去。

                  抗血清是用抗參考菌株 6: B , 6: E及 11: B全菌體懸液制得的。凝集試驗是在玻片上用待檢抗原與 3個型的血清進行。出現細的顆粒狀凝集時 ,即為特異性的菌體凝集。與標準菌體的試驗將有助于結果的讀取與解釋。

                  當出現非特異性的部分凝集時 ,則用 10倍稀釋的血清與待檢抗原和參考抗原分別作試管凝集 ,將有助于鑒定菌體抗原。

                  4、免疫擴散試驗

                  免疫擴散試驗依據所用的抗原與抗體 ,作“莢膜”或菌體抗原的定型。一般用雙擴散試驗。在固體瓊脂上 ,打一個中央孔和六個周邊孔。

                  莢膜定型 :凝膠培養基是用含 1: 10000硫柳汞的 0. 2M磷酸鹽緩沖液 ,將優級瓊脂或同質量產品配成 1%的濃度后制成。用于莢膜定型的抗原及抗血清與間接血凝法所用的相同。參考抗血清放在中央孔 ,待檢抗原與參考的同源性抗原加到周邊孔內。菌體定型 :凝膠培養基是用 8. 5%氯化鈉溶液 ,將特殊的優級瓊脂或者同質量的產品,配成 0. 9 %的濃度后制成。 1毫升 8. 5%氯化鈉溶液 (含 0. 3%福爾馬林 )將每塊板上的細菌生長物洗下。并在 100℃加熱 1小時 ,離心沉淀菌體 ,上清液即為抗原。抗血清用雞制備 , 12到 16周齡的公雞頸中部皮下 ,接種 1毫升死菌苗。 3星期后采血 ,并分離血清。

                  5、血清型命名

                  一般采用 2種定型系統一種是莢膜定型 ,采用血凝試驗或免疫擴散試驗。另一種是菌體定型。一般同意 ,將莢膜──菌體結合起對血清型命名。

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